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GV3101 菌株使用說明書

 發布時間:2020-11-11 點擊量:185

產品說明

GV3101 菌株為 C58 型背景,核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因 rif,為了便于轉化操作,此菌

株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型 Ti 質粒 pMP90 (pTiC58DT-DNA),此質粒含有 vir 基因 (vir 基因是

T-DNA 插入植物基因組必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)質粒自身的 T-DNA 轉移功能被破壞,但

可以幫助轉入的雙元載體 T-DNA 順利轉移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)Ti 質粒含有篩選標簽:gent,

賦予 GV3101 菌株慶大霉素抗性,適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉基因操作。本公司生產

GV3101 化學轉化感受態細胞經特殊工藝制作,pCAMBIA2301 質粒檢測轉化效率>104 cfu/μg DNA。

 

常規操作方法

1. -80℃保存的農桿菌感受態于室溫或手心片刻待其部分融化,處于冰水混合狀態時插入冰中。

2. 100 μl 感受態加 1 μg(體積不大于 10 μl)質粒 DNA,用手管底混勻,依次于冰上靜置 5 分鐘、

液氮 5 分鐘、37℃水浴 5 分鐘、冰浴 5 分鐘。

3. 加入 700 μl 無抗生素的 LB YEB 液體培養基,于 28℃振蕩培養 2~3 小時。

4. 6000 rpm 離心一分鐘收菌,留取 100 μl 左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的 LB YEB

平板上,倒置放于 28℃培養箱培養 2-3

(當平板只含有 50 μg/ml kan 時,28℃培養 48 h 即可;平板中同時加入 50 μg/ml kan,20 μg/ml rif 時,

28℃培養 60 h;如果使用的平板含有 50 μg/ml rif 則需要 28℃培養 72-90 h)。

 

注意事項

1. 加入質粒時體積不應大于感受態體積的 1/10;質粒不純或存在乙醇等有機物污染,轉化效率急劇下降;質粒增大一倍,

轉化效率下降一個數量級。

2. 混入質粒時應輕柔操作。轉化高濃度的質??上鄳獪p少終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽性克隆密度過大時,由于營養不足,陽性克隆生長變慢,菌落變小,為了獲得大的菌落,應減少質粒用量。

4. 利福平濃度不應高于 25 μg/ml,過高的利福平濃度不利于農桿菌生長,會降低其生長速度和轉化效率。本公司 GV3101

感受態計算轉化效率時所用平板只含有 50 μg/ml kan,若所用平板含有 20 μg/ml rif 則轉化效率降低到 1/2。

5. 培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌;根據所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止 Ti 質粒丟

失,但鏈霉素不利于農桿菌的轉基因操作,所以一般培養農桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素,Ti 質粒丟失的概率極低 (

以忽略)。

 

 

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